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2021-07-28

基本原理細胞凍存時保存細胞的最基本方法，當不加保護劑直接凍存細胞時，細胞內和外環(huán)境中的水會形成冰晶，從而引起細胞死亡。因此，正常情況下凍存細胞，通常會向培養(yǎng)液中加入保護劑，使用逐步降低溫度的方法，以減少凍存過程中細胞內冰晶形成、保護細胞。注意事項1、凍存細胞選擇細胞增殖旺盛、情況穩(wěn)定、無污染、處于對數生長期的細胞。2、實驗操作過程必須遵循無菌操作。3、細胞凍存液的配方應根據細胞的類型進行調整，摸索對應細胞最適的配方。4、細胞凍存過程，降溫速率要小，遵循慢凍原則，可借助程序降溫...

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干貨分享--WB實驗問題總結與處理方案（三）

2021-07-27

41、跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對嗎？答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。42、蛋白質的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？答：這么廣的分布不好轉移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉，12％SDS-PAGE，濕轉120mA，45-60min...

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干貨分享--WB實驗問題總結與處理方案（二）

2021-07-27

Westernblot實驗過程中常見問題匯總及處理方案。21、想分離的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？濃縮膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作WesternBlot嗎？答：分離膠用7％，濃縮膠3.5％，200kd的蛋白不好做。22、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？答：可以濃縮樣品，也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，...

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干貨分享--WB實驗問題總結與處理方案（一）

2021-07-27

Westernblot實驗過程中常見問題匯總及處理方案。1、westernblot的優(yōu)點及缺點答：優(yōu)點：靈敏，特異性高，常規(guī)可達ng級，Ecl顯色法理論上可達pg級。缺點：通量有限。2、為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白？答：原因有很多：首先排除WB過程是不是抗體的問題，重新實驗、更換抗體；其次排除蛋白是否降解，提取的時候需要加入蛋白酶抑制劑，a)你的細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；最后考慮此種細胞是否表達該蛋白，表達量高低。3、提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？答...

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染色質免疫共沉淀（ChIP）

2021-07-27

染色質免疫沉淀（chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP）是目前研究體內DNA與蛋白質相互作用的方法。它的基本原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質－DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。ChIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。而...

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分子生物學常用數據庫匯總及推薦

2021-07-27

分子生物學主要研究具體生物大分子在某一生物學行為過程中的表達變化、功能和作用方式；主要涉及基因的表達調控、蛋白相互作用、信號分子間的交互對話等。分子生物學實驗常需要我們在具體實驗前對所關注的基因的一些基本信息、可能受哪些因素調控、與哪些分子可能存在潛在的相互作用，可能參與哪些生物學行為等進行一些初步的判斷，然后根據這些信息，提出合理的實驗設計，并通過生物學實驗加以驗證。那么，如何獲得上面的這些信息，除了根據實驗結果提供的線索和深入研究相關文獻以外，還會用到一些分子生物學數據庫...

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逆轉錄PCR

2021-07-26

RT-PCR，逆轉錄PCR或稱反轉錄PCR（ReverseTranscriptionPCR），是聚合酶鏈式反應的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，RNA在逆轉錄酶的作用下被逆轉錄成為互補DNA（complementaryDNA，cDNA），再以此為模板通過PCR進行DNA擴增?；驹恚河媚孓D錄酶以RNA為模板合成與其互補的DNA（cDNA）的過程。因為mRNA末端存在PolyA，所以用OligodT作為通用引物與其互補。商品化的反轉錄試劑盒里通常除了OligodT之外，...

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